TRABAJOS CIENTIFICOS
Plantas medicinales, aromáticas y tintóreas.
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Anales de SAIPA - Sociedad Argentina para la Investigación de Productos Aromáticos
VI CONGRESO NACIONAL DE SOBRE RECURSOS NATURALES AROMÁTICOS Y MEDICINALES - San Juan (San Juan), Argentina - 1992
Volumen XIII - 1995 - pág 53 a 62.CULTIVO IN VITRO DE ESPECIES AROMÁTICAS: POLEO (Lippia turbinata), MENTA (Mentha piperita) y MALVA ROSA (Pelargonium graveolens)
SANDRA SHARRY * y WALTER ABEDINI *** Jefe de Trabajos Prácticos. Profesional Asistente CIC PBA.
** Profesor Titular. Investigador Adjunto CIC PBA. Centro Experimental de Propagación Vegetativa (C.E.Pro. Ve.).Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales. Universidad Nacional de La Plata. Diagonal 113 n°- 469 (61 y 118). 1900La Plata, Prov. de Bs. As. - Argentina
RESUMEN
Clones selectos de poleo, malva rosa y menta cultivados en la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, Universidad Nacional de La Plata, fueron propagados por cultivo in vitro, utilizando diferentes biotécnicas. Los explantos se obtuvieron de individuos de 1 a 3 años de edad y se lograron plantas completas con buen porcentaje de sobrevivencia. La tasa de multiplicación de estas especies fue ampliamente incrementada con el uso de estas técnicas, respecto de los métodos convencionales de propagación.
SUMMARY Selected clones of Lippia turbinata, Pelargonium graveolens and Mentha piperita were propagated by in vitro culture using various techniques.
The explants were obtained from one to three years old plants, and whole plants with a good survival percentage were obtained.
The use of these techniques made possible to increase the rate of multiplication of these species, if we think of any conventional methods for propagation.
INTRODUCCIÓN
Existen numerosos antecedentes sobre el uso de técnicas biotecnologías aplicadas al cultivo de plantas aromáticas con distintas finalidades:
- Conservación de germoplasma. (8).
- Obtención de plantas libres de patógenos. (7).
- Multiplicación clonal in vitro de individuos selectos. (1)
- Obtención de metabolitos secundarios de interés económico, por cultivos de células en suspensión. (6).
En la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales de la Universidad Nacional de la Plata, se cultivan clones de diferentes especies aromáticas de las cuales se llevan registros fenológicos y de comportamientos desde hace algunos años. Estos clones de las tres especies en estudio han demostrado una alta capacidad de adaptación a las condiciones del sitio, buenos rendimientos de esencias y buen estado sanitario.
El método tradicional de propagación de estas especies es en forma vegetativa (estacas y separación de matas) lo que limita el número de plantas obtenidas por individuo selecto.
El cultivo de aromáticas se presenta como una alternativa de producción para la zona, por lo que se decidió implementar un plan de investigación para ajustar técnicas de cultivo in vitro con el objeto de clonar individuos selectos de estas especies en forma masiva.
El objetivo de este trabajo es lograr la propagación de individuos isogénicos de poleo, malva rosa y menta por cultivo in vitro mediante el uso de diferentes biotécnicas.
MATERIALES Y MÉTODOS.
Las plantas madres son individuos de 1 a 3 años de edad cultivados en la Facultad de Ciencias Agrarias y Forestales, Universidad Nacional de la Plata. Los explantos recolectados fueron:
- secciones nodales
- secciones internodales
- hojas
- yemas apicales
La desinfección fue ajustada para cada especie, utilizando diferentes agentes (fungicidas, hipoclorito de sodio, etanol y bicloruro de mercurio) en distintas concentraciones y tiempos de inmersión en cada uno de ellos.
Se utilizó el medio de cultivo de Murashige-Skoog (5) completo, a la mitad o a un cuarto de su concentración para macro y micronutrientes, suplementado con sacarosa entre el 1% el 3% y semi-sólido con 0,6% al 0,8% de agar por litro; el pH, en todos los casos se ajustó a 5,8 - 6,2.
Se adicionaron diferentes reguladores de crecimiento (ANA, 6-BAP, KIN, AIB, 2,4D y AIA) en rango de 0,01 ppm a 10 ppm, de acuerdo a la respuesta buscada (inducción de callos, proliferación de yemas, rizogénesis o embriogénesis).
Se probaron las vitaminas de Murashige-Skoog, Gressoff and Doy (3) y de Jacquiot (4) en diferentes concentraciones.
Los envases utilizados para la siembra de los explantos fueron: Erlenmeyer de 125 ml con 50 ml de medio de cultivo cada uno y esterilizados en autoclave durante 20 min a 1 atm de presión y 1209 C de temperatura.
Las condiciones ambientales de los cultivos se lograron en cámaras climatizadas y fueron de 21eC +/- 29 C de temperatura y 16 h de luz. Las plantas así obtenidas, se plantaron en sustrato estéril (vermiculita) y se regaron con una solución de fungicida (Raptan 1000 ppm), para luego, ser transplantadas a envases con tierra de jardín y se rusticaron en condiciones de invernáculo con riego por neblina.
RESULTADOS
Los resultados para cada uno de las especies fueron los siguientes:
- Lippia turbinata (poleo).
Se obtuvieron plantas completas por vía de organogénesis indirecta (Fig. 1 y 2). Los mejores explantos resultaron ser los ápices y las hojas juveniles.
Una óptima desinfección de los mismos se logró utilizando la siguiente secuencia de agentes químicos:
- Inmersión en una solución de Raptan a 300 mg/1 1-1, con agitación durante 30 min.
- Inmersión en una solución de hipoclorito de sodio comercial al 20% en agitación durante 30 min.
- Inmersión en una solución de etanol al 70% durante 3 min.
- Inmersión en una solución de bicloruro de mercurio al 0,2% durante 3 min.
- Inmersión en una solución de hipoclorito de sodio comercial al 10% durante 10 min.
- Dos lavados con agua destilada estéril bajo campana de flujo laminar. En los explantos así desinfectados, comienza a formarse sobre la superficie de las hojas adultas y brotes del ápice, tejido poco diferenciado (callo). Esto se manifiesta a los 10 días de sembrados en el medio de cultivo de Murashige-Skoog a mitad de concentración suplementado con 2% de sacarosa, 2 ppm de Cinetina, 10 ppm de ácido indol acético y 0,6% de agar. Estos callos subcultivados al mismo medio de cultivo pero con el agregado de 0,5 ppm de Cinetina, a los 45 días comienzan a diferenciar estructuras organizadas, yemas y brotes.
Pasados 30 días, estas yemas completas son nuevamente subcultivadas al mismo medio fresco, pero con el agregado de 2 ppm de ácido indol butírico para la inducción de rizogénesis.
Pelargonium graveolens (malva rosa).
Se obtuvieron plantas completas (Fig. 3 y 4) vía organogénesis directa, indirecta y embriogénesis somática.
Los mejores resultados se obtuvieron con explantos provenientes de secciones nodales que para ser sembrados fueron desinfectados de la siguiente manera:
- Lavado con agua corriente durante 1 h.
- Inmersión en agua oxigenada 20 volúmenes más gotas de tween 20 durante 5 min.
- Inmersión en Raptan 1500 ppm. y 8000 ppm de ácido ascórbico durante 20 min.
- Inmersión en etanol 70% durante 5 min.
- Inmersión en bicloruro de mercurio al 0,2 % durante 3 min.
- Inmersión en hipoclorito de sodio comercial al 10% durante 10 min.
- Dos lavados con agua destilada estéril con 10 ppm de ácido cítrico.
Los explantos así desinfectados son sembrados en diferentes medios de cultivo para las distintas etapas de la organogénesis directa. Los mejores resultados se obtuvieron de la siguiente manera:
- Proliferación de yemas: medio de cultivo de Murashige-Skoog a concentración completa con el agregado de sacarosa al 3%, 6-bencil amino purina 2 ppm y 0,6% de agar.
- Rizogénesis: medio de cultivo de Murashige-Skoog a un cuarto de su concentración con el agregado de sacarosa al 2%, ácido indol acético 0,01 ppm, Cinetina 0,05 ppm y 0,6% de agar.
Para las diferentes etapas de la organogénesis indirecta los mejores resultados se obtuvieron con los siguientes medios de cultivo:
- Inducción de callos: medios de cultivo de Murashige-Skoog a concentración completa con el agregado de sacarosa al 2%, ácido naftalen_ acético 2 ppm y 0,6% de agar.
- Regeneración de yemas en los callos subcultivados: medio de cultivo de Murashige- Skoog a mitad de concentración con el agregado del 1% de sacarosa, 6-bencil amino purina 1 ppm y agar al 7%.
- Formación de raíces en estas yemas: medio de cultivo de Murashige-Skoog a la mitad de concentración con el agregado de 2% de sacarosa, ácido indol butírico 2 ppm y 0,2% de agar.
Las plantas completas se obtienen a las 90 días de comenzado este proceso y son llevadas a condiciones de invernáculo para su rusticación.
Los callos fueron obtenidos con el medio de cultivo de Murashige-Skoog a concentración completa de macro, micronutrientes y vitaminas y con la adición de 6-bencil amino purina 1 ppm., ácido naftalen acético 1 ppm., sacarosa 2% y 0,7% de agar. Luego de 60 días son subcultivados a un medio para formación de embrioides, conteniendo los macro y micronutrientes de Murashige-Skoog a mitad de concentración, vitaminas de Gressoff-Doy (3), sacarosa al 1%, 6-bencil amino purina 2 ppm y 0,7% de agar. A los 30 días de cultivo, aparecen estructuras globulares que luego al ser plaqueadas al medio de Gamborg et al (2) B5 forman yemas y raíces. Estas plantas crecen favorablemente en condiciones de invernáculo.
- Mentha piperita (menta)
Se obtuvieron plantas completas por organogénesis directa (Fig. 5), siendo los explantos con mayores posibilidades las secciones nodales cercanas al ápice.
La mejor desinfección de éstos se logró con fungicida (Kaptan) a 1500 ppm y su posterior inmersión en hipoclorito de sodio comercial al 30% durante 30 min.
La aparición de yemas se provocó en el medio de cultivo de Murashige-Skoog a concentración completa adicionado con 2 ppm de 6-bencil amino purina, 3% de sacarosa y 0,6% de agar. Estas yemas enraizaron a los 20 días de la siembra en el mismo medio sin subcultivarlas, en condiciones de 21° C +/- 2° C de temperatura y 16 h de luz. Las plantas así logradas fueron transplantadas a envases con tierras y crecen favorablemente en condiciones de invernáculos.
CONCLUSIONES
La taza de propagación vegetativa por cultivo in vitro de estas tres especies aromáticas se ve sustancialmente aumentada respecto de los métodos convencionales de reproducción.
En el caso de la "malva rosa" cabe destacar que de 1 cm de explanto se obtienen por organogénesis directa alrededor de 60 yemas en condiciones de ser enraizadas. Con el uso de la embriogénesis somática esta taza aumenta aún más.
En la "menta" la ventaja de aplicar esta biotécnica para su micropropagación quedó demostrada con la proliferación de yemas y su posterior enraizamiento, en el mismo medio de cultivo, con lo que el tiempo de producción de plantas isogénicas se acorta respecto a otros trabajos realizados con esta especie.
El "poleo" muestra una alta capacidad de generar callos, siendo este en la mayoría de los casos, organogénico. Además demostró cierta tendencia a formar estructurras proembriónicas, por lo que se sigue ajustando la técnica en este sentido.
BIBLIOGRAFÍA
- Conger,B. V. (1986). "Cloning agricultural plants via in vitro techniques".
- Gamborg, D. L., R. A. Miller y K. Ojima, (1968). "Nutrient requeriments of suspension cultures of soybean root cells". Exp. Cell. Res. 50. 151-158
- Gressoff, P. M. and C. H. Doy. (1975). Botanical Gazzette. 16. 196-200
- Jacquiot, C. (1975) "Quelques resultats concernant l'action de cytokinines et de vitamines sur le tissu cambial d'arbres cultivé in vitro". Cong. Nat. Soc. Savantes. París. Fase. II.
- Murashige-Skoog. (1962). Physiologie Plantarum. 5. 177.
- Pétiard, V. et al. (1985)." Variabilité du potentiel de biotransformation de steroides par des cellules vegetales cultivées in vitro".
- Pillai, S. K. y A. C. Hildebrandt. (1968). "Diferencias ¿ti vitro de plantas de "geranio" (Pelagonium hortorum) a partir de meristemas apicales". Phyton. 25.
- Rech, E. L. y M. J. Pires (1986). "Propagación de cultivares de menta mediante el uso de yemas axilares". Plant cells reports. 5. (1).
FIGURASFigura 1 - Callos organogénicos de Lippia turbinata.
Figura 2 - Callos organogénicos de Lippia turbinata.
Figura 3 - Rizogénesis en yemas de Pelargonium graveolens.
Figura 4 - Planta completa de Pelargonium graveolens.
Figura 5 - Planta completa de Mentha piperita obtenida in vitro. C.E. Pro. Ve. 1993.
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