TRABAJOS CIENTIFICOS Plantas medicinales, aromáticas y tintóreas.

El rescate de las cosas que se han hecho bien.

Anales de SAIPA - Sociedad Argentina para la Investigación de Productos Aromáticos
V CONGRESO NACIONAL DE RECURSOS NATURALES AROMÁTICOS Y MEDICINALES - SALTA 1989
Volumen XI - 1993 - pág 107 a 112.

UTILIZACIÓN DE LOS MAPAS CROMATOGRAFICOS COMO MÉTODO DE EVALUACIÓN DE LOS ACEITES ESENCIALES
Arnaldo L. Bandoni, Elena Nadinic, Susana Caula y Jorge D. Coussío *

^* Cátedra de Farmacognosia, Facultad de Farmacia y Bioquímica. Junín 956, 2° piso, (1113) Buenos Aires, Argentina.

INTRODUCCION

Los aceites esenciales son productos generalmente volátiles y con una composición química muy compleja, con componentes cuantitativamente minoritarios que suelen ejercer una gran influencia tanto en lo que se refiere a su calidad como para su control analítico. Para controlar este tipo de productos es necesario disponer de un sistema analítico con óptimas propiedades separativas, permitiendo evaluar individualmente tanto a los principales componentes, como a muchos otros presentes en proporciones muy distintas. El método de elección para ello es la cromatografía en fase gaseosa (CG). Sus principales ventajas son:

1. especificidad para analizar compuestos volátiles.
2. gran poder de separación (muy alta resolución).
3. permite analizar dentro de una misma mezcla compuestos presentes en un rango de concentraciones de 10⁶, (por ejemplo un 99% de un compuesto A junto a un 0.001% de un compuesto B).
4. es un método rápido, sencillo y económico.
5. son necesarias mínimas cantidades de muestra.
6. por dar una respuesta instrumental, permite una fácil normalización, comparación y almacenamiento de ¡a información obtenida.

Las limitaciones que tiene son:

1. alto valor inicial de inversión.
2. imposibilidad de analizar componentes no volátiles presentes en casi todas las esencias.
3. ciertas limitaciones técnicas para obtener un valor cuantitativo absoluto y preciso. Necesidad de normalizar el equipo y validar el método.

Este último punto hace imprecisa muchas evaluaciones cromatográficas, y es una de las principales causas por la cual este método es muchas veces discutido o no tenido en cuenta en la redacción de algunas normas de calidad.

Sin embargo ya son varios los organismos normativos que exigen o por lo menos propician su uso. Las normas ISO, la Farmacopea Francesa y las normas de la Fragrance Material Association de Estados Unidos, son algunas de ellas. Si se analiza cual fue la filosofía empleada para su inclusión, se verá rápidamente que ha sido aceptado no como un método cuantitativo, sino como un método cualitativo de análisis. Es decir que no es un método autosuficiente, y su respuesta no significa mucho si no se acompaña de otros datos o métodos de análisis. Pero si se evidencia que, como método cualitativo, a pesar de sus limitaciones, es irreemplazable.

Existen otros métodos instrumentales que podrían compararse, como la cromatografía en fase líquida de alta perfomance (HPLC), la espectroscopia infrarroja (IR) o la de resonancia nuclear magnética (NMR). Esta última representa una alta inversión en la compra de equipo y mantenimiento, además de necesitarse mucha experiencia teórica previa. La HPLC no tiene especificidad para productos volátiles, y la resolución del sistema nunca llega a ser tan alta como en CG. La inespecificidad puede ser una ventaja, si lo que se quiere es analizar tanto los productos volátiles como los no volátiles en una mezcla. El infrarrojo, bien puede coadyuvar en el análisis, pero es más difícil su evaluación: la CG da una respuesta por cada componente volátil de una mezcla, mientras que la IR da una respuesta compleja por cada uno de los compuestos, por lo que es necesaria mucha experiencia o conocimiento teórico para el análisis de una mezcla por esta técnica. No obstante, también ha sido incluida en algunas normas para aceites esenciales, con el mismo criterio sustentado para la CG: dar un parámetro más, no absoluto, de confirmación de calidad.

El objetivo de este trabajo es dar un protocolo general para contribuir al análisis cromatográfico de los aceites esenciales normalizados en nuestra Farmacopea Nacional Argentina Sexta Edición (FNA VI), ya que muchos de ellos carecen totalmente de métodos analíticos para determinar su calidad. Debe considerarse que estos códigos deben incluir métodos de ensayos lo más sencillos posibles, como para permitir su aplicación en todo laboratorio, incluyendo la oficina farmacéutica. Por este motivo, acompañamos a los análisis por cromatografía en fase gaseosa, un método por cromatografía en capa fina (TLC), por considerarlo mucho más económico y de fácil interpretación, aunque no tenga la resolución, la sensibilidad o la precisión de la CG.

CROMATOGRAFÍA EN FASE GASEOSA DETERMINACIONES CUALITATIVAS

En todo proceso analítico existen tres factores a considerar para evaluar su performance: el producto a analizar o analito, el sistema (equipamiento y método) empleado y la interpretación o el procesamiento del resultado obtenido.

• El analito:

  En nuestro caso, es un aceite esencial o un producto derivado de los mismos. Como todo material que tiene un origen natural, implícitamente debe considerarse que nunca habrá dos partidas iguales. Las variaciones genéticas, climatológicas, edáficas o geográficas, los métodos de extracción, el proceso de almacenamiento, la estabilidad térmica y hasta el añejamiento natural, son algunos de los factores que constantemente producirán modificaciones en las características fisicoquímicas de la esencia. Esto es una condición que no puede omitirse. Su ponderación en el resultado final está limitado solamente por el grado de exactitud y sensibilidad con que mediremos, y por el grado de precisión con que queramos identificar una calidad de un analito.

  La primera conclusión que sacamos de este concepto es que siempre, cualquiera sea la constante que analicemos, deberemos considerar un rango de valores y no un parámetro fijo. Si es posible, puede ser más práctico buscar valores relativos o relacionales, más que parámetros absolutos.

  La segunda conclusión, es que se necesita conocer cuáles son las cualidades posibles de cada esencia en función de las variables ya mencionadas.

  Y la tercera conclusión es que resulta muy difícil evaluar un analito de este tipo, si no se dispone de un producto normalizado y considerado muestra patrón.

  Además, y como ocurre con cualquier analito, sea sintético o natural, deben tenerse en cuenta:

  1. posibles impurezas.
  2. posibles adulterantes.
  3. posibles productos de descomposición.
  4. posibles cualidades comerciales.



• El equipo:

  Dentro del esquema general de un cromatógrafo en fase gaseosa, para el análisis de aceites esenciales es importante recalcar los siguientes elementos:

  a) inyector: se pueden usar las técnicas directas, "on column" o tipo split o divisor de inyección. Este último es el más universalmente empleado, aunque no deberían menospreciarse las ventajas de los primeros sistemas, en cuanto a la menor exposición, y por ende degradación térmica que sufren los analitos en la puerta de inyección.

  Conviene inyectar las esencias diluidas en algún disolvente como el etanol, a los fines de minimizar la expansión de la muestra en la cámara de inyección.

  b) columnas: Se deben considerar el tipo, la longitud y ancho, la fase estacionaria y su espesor. En cuanto al tipo no cabe duda que la mejor columna es la capilar de sílice fundido, por su inercia, su facilidad de manipulación, y su inercia ante casi cualquier analito. El largo debiera seleccionarse en función del nivel de resolución que se pretenda y la velocidad de análisis deseada. Para muestras complejas como las esencias suele preferirse columnas largas: de 25 a 50 metros. En cuanto al ancho, por la longitud seleccionada y por la cantidad de material inyectado, no existe una preferencia determinada, y sólo puede tener alguna ventaja de ahorro de tiempo el disponer de columnas anchas.

  Históricamente la fase estacionaria más citada es el polietilenglicol de peso molecular 20000, aunque cada vez se estén empleando más las metil siliconas, por su mayor rango de temperaturas de trabajo y la incomparable estabilidad e inercia química.

  El espesor de fase fija conviene que sea pequeño, a los fines de reducir el tiempo de permanencia de la esencia en la columna, y optimizar la resolución del sistema. Puede resultar de gran utilidad disponer de un divisor de entrada a dos columnas de distinta polaridad, con el fin de obtener en un mismo análisis dos respuestas, lo que aumenta al doble la exactitud de la respuesta obtenida.

  Detector: Existen algunos sistemas de muy alta sensibilidad y especificidad para el análisis de determinados compuestos presentes en las esencias. Tal es el caso de los detectores para compuestos azufrados, nitrogenados, o halogenados. Pero el detector más empleado es el de ionización de llama, le respuesta casi universal y alta sensibilidad.

  Temperaturas de trabajo: Las de inyección y detección nunca debieran exagerarse, para limitar la descomposición de las esencias. En cuanto al homo, lo normal es emplear el rango útil aceptado por la columna en uso,

• El método: El análisis cualitativo de un cromatograma instrumental se expresa básicamente por una constante: e, tiempo de retención (tr). Este valor puede procesarse en distintas formas, para lograr una mayor exactitud en la descripción del resultado. Para independizar el tr de muchas de las variables comunes a cualquier proceso cromatográfico instrumental, se puede emplear el tiempo de retención relativo (trr), relacionando el tr de un analito con el de otro u otros coinyectado/s como referencia/s. Si se conoce la identidad del o de los analitos, puede emplearse directamente la coinyección con los respectivos patrones. Existe la posibilidad de comparar los resultados obtenidos con los publicados en la bibliografía, y para ello es más correcto utilizar los índices de Kovats, donde un tr se relaciona con los tr de dos analitos de referencia, con valores absolutos cercanos.

Por último, y cuando la complejidad de la muestra no permite coinyectar referencias (caso muy común entre las esencias), se puede realizar una comparación del cromatograma completo, o perfil cromatográfico. Para esto se pueden utilizar el método clásico de comparación de perfiles, o la superposición electrónica de los mismos (a través de programas específicos que muestran en un monitor ambos cromatogramas o partes del mismo superpuestos o restados entre sí), lo que permite una mayor precisión en la respuesta obtenida.

• Interpretación del resultado:

  El resultado final de un análisis permite describir:

  1. presencia de un componente normal, o su ausencia.
  2. presencia o ausencia de componentes no deseados.
  3. relación de porcentajes entre dos o más componentes, identificados o no.

  Es necesario tener siempre en cuenta el nivel de sensibilidad con que se pretende analizar el analito. En productos naturales como las esencias, muchas veces no tiene sentido disponer de muy alta sensibilidad, porque de esta manera podrían detectarse centenares de compuestos, muchos de ellos sin interés analítico, lo que llevaría a diferenciar analitos que en la realidad, por el uso que se le va dar, no son diferentes. Por este motivo no es necesario disponer de equipos de tan alta sensibilidad como cromatógrafos multidimensionales o equipos multiacoplados como el CG/IR/MS para trabajos rutinarios.

  Cuando el resultado obtenido va a ser evaluado por medio de una comparación de perfiles cromatográficos, es necesario optimizar la técnica de su obtención. Por esto en general las normas publicadas suelen precisar la metodología de trabajos más que el perfil cromatográfico tipo. Lo ideal es utilizar un mismo método para un analito patrón y compararlo con el analito muestra.

TÉCNICA EMPLEADA

En todos los casos se procede a usar un mismo método de CG, variando solamente la sustancia de referencia según el caso. El resultado que se obtiene es un perfil cromatográfico, donde se pueden identificar algunos de los componentes mayoritarios, por cálculo del trr, relacionado a la sustancia de referencia correspondiente.

Columna: capilar de sílice fundido. 25 m x 0.3 mm.
Fase estacionaria: metil silicona. 0.3 micrones de espesor.
Fase móvil: nitrógeno. (30 cm/seg). Puede usarse hidrógeno.
Inyector: sistema split, relación (1:100). 240°C.
Detector ionización de llama. 240°C.
Temperatura de trabajo: inicial: 60° C.


- Aumento: 4° C/min,
- final: 200° C, 15 min.

Sustancia de referencia empleada para cada caso.

mentol: para esencias de romero, naranja, bergamota, limón, anís, hinojo y trementina.
levo carvona: para esencias de lavanda, romero, canela, clavo, tomillo y eucaliptus, lavandines.
fenchona: para esencias de lavanda y mentas.
3-octanona: para esencia de mentas.

En sucesivas diapositivas se darán ejemplos de análisis de esencias normalizadas en la FNA VI.

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

Descontamos el uso de buenas prácticas cromatográficas, las que pueden encontrarse en cualquier texto de TLC. Para este método solamente daremos la técnica utilizada por nosotros, la que fue fijada luego de evaluar los distintos métodos publicados en diversas normas y farmacopeas como las últimas ediciones de Hungría, Francia, Italia, Alemania o de Inglaterra.

TÉCNICA EMPLEADA

En todos los casos se procede a usar un mismo método de TLC, variando solamente la sustancia de referencia según el caso. El resultado que se obtiene es un perfil cromatográfico, donde se pueden identificar algunos de los componentes mayoritarios, por cálculo del Rf relativo a la sustancia de referencia. Soporte: vidrio, de 20 x 20 cm.

Fase estacionaria: sílica gel HF 254.
Fase móvil: tolueno/acetato de etilo (90:10).
Siembra: 10-15 microlitros.
Distancia recorrida: aproximadamente 15 cm.
Secado de la placa a temperatura ambiente.
Revelado:

1. luz UV 254 nm. Luego 366 nm.
2. anisaldehido/ácido sulfúrico/etanol.

Luego estufa: 105BC.

En sucesivas diapositivas se darán ejemplos de análisis de esencias normalizadas en la FNA VI.

Sustancias de referencia empleadas para cada caso

En el caso de que no se puedan conseguir alguna de estas sustancias, puede emplearse algún colorante, para determinar los Rf_x referidos al mismo.

Romero: alcanfor y acetato de bornilo.
Tomillo: timol,
Eucaliptus: eucaliptol.
Mentas: mentol, mentona y eucaliptol.
Lavanda y lavandines: linalol y acetato de linalilo.
Clavo: eugenol.
Canela: eugenol y aldehido cinámico.
Limón: limoneno y citral.
Naranja: limoneno.
Bergamota: linalol y acetato de linalilo.
Quenopodio: ascaridol.
Anís e hinojo: anetol.
Trementina: alfa pineno.

Las esencias de azahar, melissa y rosa no fueron analizadas, ya que es muy raro que las comercializadas sean naturales. Se considera que estas tres esencias debieran ser suprimidas en una futura edición de la FNA, dado su elevado precio y su escaso uso en la preparación de medicamentos.

Por otros lados incluimos la esencia de naranja, lavandín y menta arvensis desmentolada, porconsiderar que las mismas deberían ser incluidas en una nueva edición.

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