En los artículos anteriores sobre la aplicación de la cromatografía al estudio de los productos aromáticos (1) hemos podido apreciar el valor de esta técnica en el contralor de numerosos productos y de sus componentes, así como para descubrir adulterantes y la anormalidad de composición ocasionada por diversos factores del hábitat de las plantas. Vamos a ocuparnos ahora de la aplicación de la cromatografía en fase gas-líquido al estudio de productos naturales o mezclas aromáticas de composición desconocida o parcialmente conocida.

La técnica, por si sola, difícilmente podrá descubrir totalmente la composición de un producto desconocido, especialmente los naturales que son de naturaleza muy compleja, debido al gran numero de componentes y a la circunstancia de que algunos componentes menores pueden ser absorbidos en los picos de los mayores que poseen tiempos de retención similar; o por coincidir los tiempos de retención de dos o más componentes principales, En el caso de las mezclas de aromáticos, aunque puede darse el mismo fenómeno, sin embargo, por ser de complejidad menor es mas frecuente que permita directamente descubrir la composición.

La cromatografía gaseosa puede descubrir los componentes fundamentales, lo que bastará para apreciar el valor del producto o reproducir su composición, generalmente en forma satisfactoria, desde el punto de vista aromático.

Por ejemplo, en el caso de un aceite esencial obtenido de cultivo experimental en el país, el de Artemisia alba, sobre el cual no había antecedentes de composición, el cromatograma obtenido en fase gas-líquido (se uso equipo Perkin Elmer, modelo 154C, donado a la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales por el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas), usando columna de polisuccinato de dietileno glicol al 10 % sobre chromosorb, de un metro por 1/4" a 125° C y con flujo de 23,7 ml/minuto de N2, presión 4 psi, permitió identificar claramente los tres componentes principales: cineol, alcanfor y borneol (por ubicación de los picos, olor de los eluatos y reacciones de identificación después). (Véase el cromatograma adjunto)

Aliado precioso de la cromatografía gaseosa para la identificación de: las fracciones separadas es la espectrofotometría en el infrarrojo y ayuda valiosa la espectrofotometría en el ultravioleta. La primera orienta mejor sobre la estructura química, la segunda da indicaciones valiosas sobre la presencia de dienos y tríenos conjugados, agrupaciones carbonilo, fenol, etc.

La cromatografía gaseosa permite, trabajando con cantidades muy pequeñas de muestra, del orden del microlitro, obtener un cromatograma de orientación sobre la composición del producto. En base a ese primer cromatograma (obtenido, por ej., con una columna de poli-succinato de dietileno glicol sobre chromosorb u otro soporte inerte, o de diacetato-hexaisobutirato de sacarosa, a 150° C), se pueden obtener otros a otras temperaturas, adecuadas a la volatilidad relativa de los componentes registrados en el primero. Será a menor temperatura, por ejemplo a 125° C, si se observa la acumulación de componentes en la parte inicial; o mayor, a 175° C o 200° C si se observa acumulación de componentes hacia el final.

Para visualizar mejor y facilitar la resolución de la mezcla conviene obtener cromatogramas con dos fases líquidas distintas y columnas de distinta longitud, usando como términos de comparación sustancias patrón como alcanfor, limoneno, linalol, borneol, etc. Es posible así obtener varias "tarjetas de identidad" del producto, debiéndose fijar exactamente las condiciones de la operación y elementos que intervinieron en ella. Para resolver mezclas aromáticas o productos naturales complejos es menester, en la mayor parte de los casos, combinar la cromatografía gas-líquido con otras técnicas físicas (como las ya indicadas) o químicas.

Una técnica física útil resulta el fraccionamiento previo, en columna de ácido silícico, usando como disolvente de fraccionamiento éter de petróleo (para separar los hidrocarburos) o mezclas de éter de .petróleo con benceno o con éter etílico, en diversas proporciones, para separar los componentes oxigenados.

A cada fracción así obtenida se aplica luego la cromatografía gaseosa, lo que permitirá una mejor identificación de los componentes.

Es indispensable a estos fines disponer de patrones aromáticos puros (mencionados más arriba) de comparación, que ayudarán a la identificación, y particularmente de alcanfor, elegido generalmente como unidad de comparación para establecer tiempos de retención comparables.

El fraccionamiento químico del producto puede ayudar eficazmente en la resolución de las mezclas naturales o sintéticas, facilitando la identificación de sus componentes, aunque a veces provoca isomerizaciones o transformaciones que falsean los resultados.

El fraccionamiento químico comprende (2):

1. La separación de ácidos libres por absorción en solución de CO3Na2 al 5 %;
2. La separación de hidroxilactonas y fenoles y componentes fenol-carbonílicos por absorción con HOK al 0,5 %;
3. La separación de lactonas y saponificación de formiatos por tratamiento con HOK al 5 %;
4. La separación de los componentes carbonílicos:
   1. Se estima total mediante el reactivo Girardo-T; las hidrazonas obtenidas pueden luego ceder las cetonas en medio ácido mineral;
   2. Mediante solución saturada de bisulfito sódico se pueden separar los aldehidos y algunas cetonas y luego liberarlos por tratamientos con álcali;
   3. Mediante absorción con solución saturada de sulfito sódico se pueden separar los aldehidos y algunas cetonas (mayor número que con bisulfito) y luego liberarlos mediante álcali;
   4. Se puede practicar primero una separación con sulfito y luego completarla con reactivo Girard-T (cetonas).
5. Eliminación de esteres y separación de los ácidos combinados, por saponificación del aceite o mezcla. En el medio alcalino se absorben los ácidos liberados de los esteres y si aun estaban presentes las hidroxilactonas, lactonas, fenoles, aldehidos y parcialmente las cetonas. Se recuperan por arrastre con vapor de agua: alcoholes litares originales y liberados de los esteres, éteres, éteres de fenoles, óxidos e hidrocarburos.

Cada una de las fracciones obtenidas por vía química se pueden examinar por cromatografía gaseosa, combinada con la espectrofotometría infrarroja y ultravioleta, o la cromatografía sobre placa (capa delgada de ácido silícico), así como preparar derivados de punto de fusión característico como: 2,4-dinitrofenilhidrazonas de los carbonílicos, 3,5-dinitrobenzoatos de los alcoholes y de los fenoles, derivados bromados de los hidrocarburos, etc.

1. En los capítulos anteriores de esta serie hemos transcripto cromatogramas de aceites esenciales y sus fracciones obtenidas por distintos métodos.
   1. Para el aceite esencial de lemon grass se ha transcripto el cromatograma de un aceite completo y del mismo después de eliminar el citral por absorción con solución saturada de sulfito sódico, lo que permitió observar en el segundo alcoholes y esteres que eran absorbidos por los picos del neral y del geranial (constituyentes del citral) en el primero y observar mejor los demás componentes (véase boletín de SAIPA N° 5).
   2. Otro tipo de fraccionamiento ha sido ilustrado en las esencias de limón y mandarina, aplicando el fraccionamiento mediante columna de ácido silícico y presentando los cromatogramas de las esencias enteras y de las fracciones obtenidas (Boletín de SAIPA N° 7).
   3. En el caso del aceite esencial de ylang ylang comercial la cromatografía gaseosa permitió diferenciarlo claramente de un aceite esencial natural y establecer su composición (véase Boletín de SAIPA N° 5).

2. Aceite esencial de Laurelia serrata Philipi (huan huan).

   Las hojas de este árbol, que crece silvestre en el Parque Nacional del Nahuel Huapi, son estimadas por su intenso aroma parecido al del laurel. Se le conoce en la región con el nombre de huan-huan. Su aceite esencial fue estudiado químicamente por varios investigadores (3).

   La aplicación de la cromatografía gaseosa permitió corroborar la presencia de los componentes hallados y descubrir otros: estragol y varios carbonílicos. Damos a continuación el detalle de los cromatogramas obtenidos para el aceite esencial completo y para el insaponificable del mismo arrastrado por vapor de agua.




Cromatograma del aceite esencial completo de Laurelia serrata Philipi, obtenido con columna "P" (polisuccinato de dietileno glicol) de un metro X 1/4 pulgada a 150° C y 4 psi de N, (flujo de 24,3 mi/minuto).

Pico		Tiempo de retención minutos	Componente
1	Muy pequeño	0,8	-
2	Mediano	1,0	Acetato de linalilo
3	Mediano	1,15	Limoneno
4	Grande	1,35	Cineol
5	Mediano	1,8	Carbonílico
6	Pequeño	2,3	Carbonílico
7	Muy grandfe	5,2	Linalol
8	Pequeño	7,5	Carbonílico (alcanfor)
9	Pequeño-mediano	10,8	Estragol
10	Grande	24,9	Safrol
11	Pequeño	31,4	-
12	Pequeño	35,2	-
13	Grande	43,7	Metileugenol
14	Pequeño	47	-
15	Pequeño	62	Carbonílico
16	Mediano	70	Eugenol




Cromatograma del insaponificable del aceite esencial de Laurelia serrata. Columna "P" de 1 m x 1/4 pulgada a 150°C y 4 psi de N., (24,3 ml/min.)

Pico		Tiempo de retención minutos	Componente
1	Pequeño	0,6	-
2	Mediano	1,15	Limoneno>
3	Grande	1,35	Cineol
4	Pequeño	1,8	-
5	Muy pequeño	2,3	-
6	Muy grande	5,2	Linalol
7	Pequeño	7,5	¿Alcanfor?
8	Pequeño-mediano	10,8	Estragol
9	Grande	24,9	Safrol
10	Grande	43,7	Metileugenol

3. Aceite esencial de yerba mate (Ilex paraguayensis St Hilaire), elaborada.

   Se transcribe a continuación parte del estudio realizado sobre este aceite esencial en Resumen y conclusiones, aplicando la cromatografía gaseosa y otras técnicas físicas y químicas para descubrir su composición. (Ver texto original y bibliografía en "Anales de la Sociedad Científica Argentina", t. CLXXVIII, Entregas I a III).

   2. Cromatografía en fase gas-líquido. Se usó un aparato Perkin Elmer, modelo 154-C, donado a la facultad de Ciencias Exactas y Naturales por el Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Se ensayaron diversas fases fijas para la partición, y como gas, nitrógeno, puro y seco.
      1. Con "saib" (diacetatohexaisobutirato de sacarosa), suministrado por Indarco S.R.L., representantes de Eastman Company; se usó en la proporción del 10 % sobre tierra de infusorios lavada y en columna de vidrio de un metro de largo (en U) por 1/4 de diámetro; se realizaron cromatografías a 150-175 C y 200°;
      2. Con polisuccinato de dietileno glicol sobre Chromosorb R (columna "P" de Perkin Elmer) en columna de acero inoxidable de 1 m x ¼"; se hizo cromatografía a 150°C.

      Se transcriben a continuación las tablas de tiempos de retención correspondientes a varios cromatograrnas obtenidos con una y otra fase fija y en las condiciones que en cada caso se indican, como también los gráficos correspondientes.

      Se han obtenido numerosos cromatogramas de fracciones de los aceites esenciales (F) y (FR), pero no se transcriben en su totalidad para ahorrar espacio, habiéndose seleccionado para su transcripción los más ilustrativos.

   N° 1
   Cromatograma del aceite esencial (F) libre de ácidos, fenoles y la mayor parte de los componentes volátiles (mediante destilación en columna analítica) obtenido usando: columna "P" de un metro, a 150°C y 4 psi (21,6 ml/min)

   Pico registrado	Tamaño	Tiempo de retención minutos
   1°	Muy pequeño	0,4
   2°	Pequeño	0,8
   3°	Pequeño	1,0
   4°	Pequeño	2,0
   5°	Pequeño	2,6
   6°	Mediano	3,1
   7°	Pequeño	3,8
   8°	Pequeño	4,2
   9°	Mediano-grande	4,7
   10°	Muy pequeño	5,6
   11°	Mediano-grande	6,2
   12°	Muy pequeño	7,6
   13°	Muy pequeño	8,0
   14°	Mediano	9,4
   15°	Mediano	9,7
   16°	Mediano-pequeño	10,6
   17°	Mediano-pequeño	13,0
   18°	Mediano	15,2
   19°	Mediano	15,9
   20°	Muy pequeño	17,6
   21°	Muy pequeño	17,9
   22°	Muy grande	19,4
   23°	Mediano	22,2

   
   

   En el cromatograma N° 1 transcripto faltan, indudablemente, los componentes más pesados, que, presentes en pequeña proporción (por ejemplo los fenólicos), tienen tiempos de retención muy altos y no son bien registrados.

   
   
   N° 2
   Cromatograma del aceite esencial (F) después de saponificado y eliminados los ácidos combinados: constituido en consecuencia por alcoholes, éteres e hidrocarburos. Columna "P" a 150°C y psi.

   Pico registrado	Tamaño	Tiempo de retención minutos
   1°	Mediano	0,8
   2°	Pequeño	1,5
   3°	Pequeño-mediano	2,0
   4°	Pequeño-mediano	2,3
   5°	Pequeño	2,9
   6°	Mediano	3,3
   7°	Pequeño	4,0
   8°	Grande	4,9
   9°	Grande	6,8
   10°	Mediano-adosado	7,2
   11°	Mediano-pequeño	8,5
   12°	Mediano	9,7
   13°	Mediano	10,9
   14°	Mediano-pequeño	12,9
   15°	Mediano	15,2
   16°	Pequeño	16,5
   17°	Mediano-grande	19,7
   18°	Pequeño	22,1
   19°	Mediano	28

   
   
   

   Podrían corresponder en este cromatograma los picos: 12°, a furfuril alcohol, el 13° a borneol-terpineol, el 15 a alcohol bencílico, el 16° a geraniol, el 17° a alcohol hidrocinámico y el 19 a feniletílico.

   También se cromatografió el aceite esencial (FR) en distintas condiciones y con las fases fijas "saib" y "P". Con la columna "P" a 150°C y 4 psi se obtuvieron 23 picos, que en general coinciden con los del cromatograma N° 1; por ejemplo, los de Tpo. de retención 2,0 (probablemente felandreno), de 5,7, que dio reacción positiva de furfural por burbujeo en anilina acética y el de 10,6, que corresponde a borneol.

   
   
   
   
   
   Cromatograma gas-líquido de aceite esencial (FR) de yerba mate, obtenido con columna de "saib" a 175 C y 6 psi de N2 (13,2 ml/min)

   Pico registrado	Tamaño	Tiempo de retención minutos
   1°	Pequeño	0,4
   2°	Muy grande	1,4
   3°	Mediano	1,8
   4°	Pequeño	1,9
   5°	Mediano-grande	2,3
   6°	Medaino-pequeño	3,1
   7°	Muy grande	3,9
   8°	Mediano	5,2
   9°	Mediano	6,0
   10°	Mediano-pequeño	6,8
   11°	Pequeño	7,5
   12°	Mediano	9,6
   13°	Mediano	10,4
   14°	Pequeño	11,6
   15°	Mediano	14,7
   16°	Pequeño	17,2
   17°	Pequeño	18,0
   18°	Pequeño	19,6
   19°	Pequeño	21,4
   20°	Pequeño	23,0
   21°	Pequeño	26,4

   
   
   

   Por la diferencia de tiempos de retención con la columna "P" puede considerarse que este cromatograma tiene unos ocho componentes más pesados que el N"? 1. En los primeros componentes hay más superposiciones que en la columna "P" que ha demostrado mayor poder resolutivo.

   También se hizo una investigación de la naturaleza de los componentes principales, corriendo una cromatografía en columna de "saib" a 150°C y empleando 20 microlitos de aceite esencial (FR), haciendo burbujear en reactivo de carbonílicos (solución de 2-4-dinitrofenilhidrazina en C1H 2N) y de esteres (potasa alcohólica muy diluida con fenolftaleina) y repitiendo la cromatografía para hacer burbujear cada componente separado en etanol purificado y determinar la absorción en el ultravioleta. Se obtuvieron los resultados que se tabulan a continuación.

   
   
   Cromatograma de aceite esencial (FR) de yerba mate para reconocimiento de componente. Columna de "saib" a 150 C y 4 psi ((18 ml/min)

   Pico	Tiempo de retención minutos	Carbonílico	Ester	Abs. en UV máximos a milimu
   1°	0,8 (peq.)	neg.	neg.	a 220 suave
   2°	invertido	neg.	ácidos	no
   3°	1,8 (med.)	neg.	neg.	255-260 y 265-272
   4°	3,0 (med.)	neg.	dudoso	225 suave
   5°	3,8 (med.)	positivo	dudoso	225 fuerte
   6°	5,8 (grande)	positivo	positivo	225 fuerte
   7°	7,8 (med.)	neg.	dudoso	265 suave
   8°	9,6 (muy gr.)	neg.	positivo	240 fuerte
   9°	13,6 (muy gr.)	positivo	positivo	230 s y 277
   10°	17,4 (grande)	positivo	positivo	225 y 285 fuerte
   11°	19,6 (med.)	neg.	positivo	220 y 277 fuerte
   12°	29 (muy peq.)	neg.	positivo	243 suave
   13°	38 (peq.)	neg.	neg.	225 y 275

   
   
   

   Si observamos los resultados vemos que hay varios picos que acusan reacción positiva de carbonílico y éster; correspondería a esteres del ácido cetónico componente principal del aceite esencial (picos 6°, 9° y 10°); de ellos el 9° y 10° de alcoholes bencénicos y el 6° de terpénico o alifático; el pico 11° correspondería a un caprilato de alcohol bencénico, por el olor y absorción en ultravioleta y el 12° a éster de ácido graso y alcohol terpénico; también el 8° sería un éster de ese tipo. El 5° pico podría corresponder a un carbonílico con dieno o doble ligadura conjugada respecto del carbonilo. Es indudable que la resolución ha sido mala, comparando el cromatograma con el obtenido con la columna "P" a 150° C y que cada pico puede incluir a varios componentes.

El aceite esencial de yerba mate es un producto intensamente aromático, presente en el producto elaborado y estacionado, en una proporción aproximada del 0,1 por mil.

De acuerdo con el método de extracción, presenta variaciones en sus características. En efecto, obtenido por arrastre suave (por ebullición a reflujo del resinoide cloroformice en agua y recogido en trampa), resulta el de color más claro y olor más agradable (S) y el menos ácido; el obtenido por arrastre con vapor a una atmósfera de presión en autoclave (F) es oscuro, con alto contenido en ácidos y componentes pesados y de olor fuerte, algo desagradable directamente; el mismo aceite, rectificado por arrastre en balón por agua a ebullición y a reflujo y recogido en trampa (FR) resultó de color amarillo oro, con olor menos agresivo, menos ácido y más aromático. Las características de los tres aceites esenciales son:

Los componentes del ácido esencial de yerba mate son numerosos, predominando en los (F) los ácidos y esteres y entre los ácidos el 4-cetoláurico, el palmítico y los normales en C8, C7, C8 y C9; en total 18 ácidos grasos (incluyendo el cetónico) y balsámicos, libres y combinados, con distintos alcoholes, entre los que se han ubicado por cromatografía gaseosa (confirmando algunos por sus 3-5-dinitrobenzoatos): feniletílico, hidrocinámíco, borneol, bencílico y geraniol. Entre los componentes carbonílicos contiene el ácido cetónico mencionado, furfuraldehido, una cetona bencénica con cadenas laterales, un aldehido bencénico y fenolcarbonílicos. Contiene varios componentes fenólicos, siete según la cromatografía en placa, con predominio de un fenol cuyo 3-5-dinitrobenzoato corresponde al del 2,5-Xilenol. Entre otros componentes contiene algunos hidrocarburos (probablemente felandreno) y una hidroxilactona.

En total se puede estimar, con los datos de la cromatografía gaseosa del aceite litare de ácidos y fenoles (23 componentes como mínimo, en columna "P" a 150°C) más los registrados en cromatografía con columna de "saib" (a 175°C aparecen ocho componentes más pesados, no registrados en la columna "P"), los ácidos libres identificados y los fenólicos registrados por la cromatografía en placa, que el aceite esencial de yerba mate contiene más de sesenta componentes.

El aceite esencial de yerba mate (hojas de Ilex paraguariensis o I. paraguayensis Saint Hilaire elaboradas y almacenadas) es intensamente aromático y está acompañado, en el producto, por un resinoide también de olor agradable e intenso. La proporción de aceite esencial es baja, del orden del 0,1 por mil en la yerba mate y de 1,0 por mil en el resinoide clorofórmico preparado a partir de la misma, que representa el 10 % con respecto a la yerba.

La composición del aceite esencial es muy compleja, conteniendo más de sesenta componentes, entre los que predominan los ácidos grasos, uno cetónico y balsámicos y sus esteres (de alcoholes bencénicos y terpénicos), encontrándose en menor proporción componentes carbonílicos, fenólicos, lactonas e hidrocarburos; difícilmente reconstituible en su composición natural, que resulta de las transformaciones sufridas en su composición luego de ser sometidas las hojas al sapecado y tostado y almacenadas después de molidas.

Constituye el presente la primera contribución al conocimiento de las características y la composición de este notable producto aromático, de peculiar aroma, característico de un estimulante de amplio consumo en Sudamérica.

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